食品界

桑叶提取物DNJ对HFD小鼠的抗肥胖作用研究

作者:佚名 来源:食品界 202008期 时间:2020-10-16

目的:探讨桑叶提取物DNJ对高脂饮食诱导的肥胖小鼠的抗肥胖作用。方法:建立C57/BL小鼠鼠肥胖症模型,给药不同剂量DNJ干预。实验分组为:空白对照组,HFD模型组...

  目的:探讨桑叶提取物DNJ对高脂饮食诱导的肥胖小鼠的抗肥胖作用。

  方法:建立C57/BL小鼠鼠肥胖症模型,给药不同剂量DNJ干预。

  实验分组为:空白对照组,HFD模型组,给药低剂量DNJ(50mg·kg-1·d-1)组,给药高剂量DNJ(100mg·kg-1·d-1)组。检测小鼠体重、附睾白色脂肪、肩胛棕色脂肪重量;白色脂肪HE染色观察形态学变化;检测棕色脂肪组织UCP1 和 PRDM16 表达。

  结果:(1)DNJ抑制HFD肥胖小鼠体重增加,改善由高脂饮食导致的白色脂肪组织过量积累,增加棕色脂肪量;(2)DNJ能够改善因高脂饮食而造成的附睾脂肪组织细胞增大。(3)DNJ能够棕色脂肪特异性基因的表达,提高HFD小鼠棕色脂肪活性。

  结论:桑叶提取物DNJ对HFD小鼠具有抗肥胖的作用,其抗肥胖作用可能与增强棕色脂肪活性有关。

  关键词:肥胖;DNJ;白色脂肪; 棕色脂肪

  随着社会的发展与人们生活方式的改变,超重和肥胖人群逐渐增多。大量研究表明,肥胖已成为糖尿病、高脂血症、高血压等疾病的危险因素。对于肥胖的预防与治疗手段主要包括饮食控制、药物治疗和手术治疗等。哺乳动物体内主要存在两种脂肪,白色脂肪和棕色脂肪。白色脂肪以储能为主,分化异常或过度堆积诱发肥胖。棕色脂肪产热耗能,起到保暖及维持机体热平衡的作用,增强机体棕色脂肪活性可有效对抗肥胖。

  桑叶是传统中医治疗常用的中药材,富含多种活性物质,如:黄酮、生物碱、多糖、氨基酸及多种维生素、微量元素等,具有降血糖、调血脂、抗炎抗氧化的功效。1-脱氧野尻霉(1-Deoxynojirimycin, DNJ)是从桑叶中分离出的一个哌啶类多羟基生物碱。关于桑叶的研究多集中在降血糖及其机理方面,对肥胖的治疗作用鲜有报道。本课题以高脂饲料诱导的肥胖模型小鼠为实验动物,给药DNJ,探讨其对肥胖的治疗作用,为充分开发利用桑叶DNJ的生物活性功能提供理论依据。

  1. 材料

  1.1 实验动物

  C57/BL 雄性小鼠,4周龄,SPF级,购自湖南斯莱克实验动物有限公司,体重(15-20)g(质量合格证号:NO.4845700029),购入后饲养于长沙医学院动物实验中心。标准环境喂养(室温:22±2℃;相对湿度:55%±10%),光照为12小时/天,给予小鼠自由饮水和饮食。

  1.2 试剂

  DNJ(纯度98%,北京世纪奥科生物技术有限公司), 胆固醇、胆酸钠(美国Amresco公司),蛋黄粉(瑞士雀巢食品公司)。普通饲料购自长沙医学院动物实验中心。甲醛溶液(福尔马林,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);石蜡 (湖南明瑞科技有限公司),二甲苯(国药集团化学试剂有限公司),HE染色试剂盒(南京雨露生物有限公司)。UCP1、PRDM16单克隆抗体,β-actin单克隆抗体购自美国SantaCruz公司。UCP1、PRDM16引物由上海生工生物有限公司设计并合成。蛋白提取试剂(碧云天生物公司),RNA提取试剂、逆转录试剂盒、SYBR Real-time PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)。

  2. 方法

  2.1 小鼠肥胖模型的建立

  C57/BL小鼠45只,普通饲料喂养1周后,随机分为空白对照组(n=10)和造模組(n=35)。空白对照组普通饲料喂养,造模型组高脂饲料(基础饲料78.9%,猪油10%,蛋黄粉10%,胆固醇1%,胆酸钠盐0.1%)饲养。自由饮食饮水,保持通风,相对湿度为55%±10%,温度为(22±2)℃,昼夜节律照明。连续饲养8周,体重增加20%以上的小鼠即为肥胖模型小鼠。

  2.2 实验分组

  C57/BL肥胖模型小鼠33只随机分为3组:肥胖模型组(HFD组),DNJ低剂量组(50mg/kg/d),DNJ高剂量(100mg/kg/d),灌胃给药,连续给药4周。给药结束禁食12 h后处理。

  2.3 指标检测

  2.3.1 脂肪组织收集

  所有动物处理前禁食过夜,称重,10%水合氯醛腹腔注射(100μL/10g) 麻醉,收集动物睾丸周围白色脂肪组织、肩胛部位棕色脂肪,准确称重。取少量新鲜附睾脂肪,用10%甲醛溶液固定,其余组织经液氮快速冷冻后-80℃保存备用。

  2.3.2 附睾脂肪组织HE染色

  经10%甲醛溶液固定24h的脂肪组织,逐级脱水、透明、浸腊、包埋、切片,HE染色后,于高分辨率显微镜下观察并拍照。

  2.3.3 Real-time PCR棕色脂肪组织中UCP1、PRDM16 mRNA表达

  取棕色脂肪组织,每100mg组织加入约1ml裂解液充分裂解,并进行液氮冰浴研磨处理。将研磨后的组织震荡混匀,室温静置后,4℃12000rpm离心5min,转移上清液EP管中提取RNA。

  将提取好的RNA按照逆转录试剂盒的操作说明,逆转录为cDNA。逆转录所得cDNA稀释25倍,以2μL cDNA为模板,β-actin为内参,荧光定量PCR仪进行PCR扩增基因片断反应,通过△△Ct值相对定量UCP1、PRDM16mRNA表达。引物序列表如表1所示。

  2.3.4 Western blot 法检测 UCP1 和PRDM16 表达

  取棕色脂肪匀浆后,4℃条件下,12000rpm离心10min,上清分装转移至0.5mL的离心管中。加入适量的含0.1%PMSF(蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟)的Western IP裂解液冰浴裂解30min,收集上清液,用BCA试剂盒测定蛋白浓度,加入SDS上样缓冲液,99℃变性10min。每组以含总蛋白40g上样,电泳分离后转移至聚偏氟乙烯( PVDF) 膜上用5%脱脂奶粉封闭1h,然后与一抗于4℃孵育过夜,用TBST洗涤后, 再与二抗孵育1h,用TBST洗涤后显影并定量分析。

  2.4 统计学方法

  实验数据用均数±标准差表示,采用SPSS19.0软件进行t检验。差异显著水平为 P< 0.05。

  3. 实验结果

  3.1 DNJ抑制HFD肥胖小鼠体重的增加

  为研究桑叶提取物DNJ的抗肥胖作用,本实验用高脂饲料喂养小鼠建立肥胖模型。与普通饲料喂养的Control 组小鼠比较,高脂饲料饲养8周后模型组小鼠体重增加34.6%。 对造模成功的HFD肥胖小鼠,给药不同剂量DNJ治疗4周后,结果如图1显示:与肥胖模型组小鼠相比:低剂量DNJ组(50mg/kg/d)、高剂量DNJ组(50mg/ kg/d)小鼠体重均降低(图1a),附睾部位白色脂肪亦明显减少(图1b);与正常饮食组小鼠比较,HFD小鼠棕色脂肪量显著下降,不同剂量DNJ组小鼠棕色脂肪重量则显著增加(图1c)。由此知DNJ能够改善由高脂饮食导致的小鼠白色脂肪组织的积累,增加棕色脂肪量,抑制HFD肥胖小鼠体重的增加。

  3.2 DNJ抑制HFD肥胖小鼠白色脂肪细胞的增大

  白色脂肪以储能为主,过度积累是肥胖的重要表征,可表现为脂肪细胞体积的增大和数量的增多。给予小鼠高脂饮食后,附睾部位脂肪累积增多。附睾白色脂肪形态学HE染色结果如图2所示,与Control 组相比,HFD组脂肪细胞形态增大。给药不同剂量DNJ(50mg/kg/d、100mg/kg/d)治疗后,附睾白色脂肪的大小则明显缩小。此结果表明DNJ可改善因高脂饮食而造成的附睾脂肪组织的细胞增大。

  3.3 DNJ提高HFD肥胖小鼠棕色脂肪活性

  通过对小鼠棕色脂肪特异性基因UCP1、PRDM16的表达量进行检测,结果如图3所示。HFD肥胖小鼠棕色脂肪UCP1、PRDM16表达均低于普通饮食组小鼠,但无统计学意義。而肥胖组小鼠经DNJ治疗后,UCP1、PRDM16 mRNA表达显著增加(图3a、图3b)。进一步对蛋白表达检测显示:棕色脂肪中UCP1、PRDM16 蛋白表达亦显著增加(图3c、图3d)。由此知DNJ可上调棕色脂肪特异性基因的表达,提高棕色脂肪组织产热活性,从而发挥抗肥胖作用。

  4. 讨论

  肥胖是由于白色脂肪分化或代谢异常诱发的一种代谢性疾病,已是多种心脑血管疾病的诱发因素之一。当饮食中摄入的脂肪增加时,肥胖的发生率也随之增加。因此,寻找安全有效的治疗方法具有非常重要的意义。棕色脂肪作为产热脂肪,可通过高表达UCP1(解偶联蛋白),促进线粒体解耦联呼吸作用,使机体多余能量以热能形式释放。提高棕色脂肪产热活性可作为一种潜在的治疗肥胖的有效手段。

  1-脱氧野尻霉(DNJ)作为桑叶中的主要活性成分之一,可显著抑制α-葡萄糖苷酶活性而有效降低血糖。 Tsuduki T等研究发现,DNJ可降低肥胖小鼠内脏脂肪量和细胞大小,但其抗肥胖机理目前并未阐明。我们的前期研究结果显示:DNJ可通过抑制3T3-L1白色脂肪分化成熟并促进其向棕色脂肪分化而发挥抗肥胖效应。本课题以HFD诱导的肥胖模型小鼠作为实验对象,给药低剂量 DNJ(50mg/kg/d)、高剂量DNJ(50mg/kg/d)4周后,DNJ可有效抑制体重的增加,附睾部位脂肪细胞大小亦明显小于HFD肥胖组小鼠,这一结果与文献报道一致,即DNJ能够改善因高脂饮食而造成的附睾组织的脂肪细胞增大,抑制HFD肥胖小鼠体重的增加。但50mg/kg/d、100mg/kg/d两个不同剂量组的作用并无明显差别。

  为进一步探究DNJ抑制肥胖小鼠体重增加的作用是否与调控棕色脂肪活性有关,本课题对小鼠肩胛部位棕色脂肪特异性基因检测发现,与正常饮食小鼠相比,HFD组小鼠UCP1、PRDM16基因的表达有所降低,说明高脂饮食可能损伤棕色脂肪发育。与HFD组小鼠比较,低剂量DNJ组及高剂量DNJ组小鼠UCP1、PRDM16基因的mRNA及蛋白表达均显著升高。此结果说明DNJ可通过增强棕色脂肪组织活性,发挥抵抗高脂饮食诱导的肥胖作用。

  通过以上结果可知:桑叶提取物DNJ具有抑制HFD小鼠体重增加的抗肥胖作用,这一作用与增强棕色脂肪活性有关,而具体的机制还需进一步的深入研究。

  基金项目:

  湖南省教育厅优秀青年项目(编号17B036);湖南省教育厅科学研究项目(编号:17A026、18A497);新型药物制研发湖南省重点实验室( 2016TP1029〕;2014 年湖南省校企合作人才培养示范基地项目( 湘教通[2014] 272 号)

  作者简介:

  李晴晴(1989-),女,汉族,安徽宿州人,研究生,讲师,研究方向:肥胖及代谢性疾病药理;

  王妍(1999-),女,汉族,湖南永州人,药物制剂专业在读本科生;

  刘灿(1999-),女,汉族,湖南株州人,药物制剂专业在读本科生;

  唐艺榕(1999-),女,湖南怀化人,汉,药物制剂专业在读本科生。

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